Телефон горячей линии для обращений по безопасности, эффективности и качеству препаратов - +7 (926) 6012045

RUS

ENG

Новости

 

Опубликован совместный труд руководителя компании «Б-Фарм» и ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

 

Эритроцитарный диагностикум для выявления опухолевого процесса

 

Л.А. Савлучинская1, И.А. Бакулин2, А.А. Молодык1

1. ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России;

Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24;

2. компания «Б-Фарм»; Россия, 121309 Москва, ул. Барклая, 13

Контакты: Людмила Александровна Савлучинская blood-research@yandex.ru

 

 

Предложен метод создания эритроцитарного диагностикума, в основе которого лежат данные патента №2452501 (от 10.06.2012) по способу получения сенситина из сыворотки жеребых кобыл, для использования этого фактора в качестве биомаркера для диагностики злокачественных новообразований. В целях выявления практической значимости предложенного диагностикума представлены результаты тестирования сыворотки крови 215 больных с опухолями различных локализаций и 67 лиц без злокачественных новообразований. Проведена оценка полученных результатов по общепринятым критериям для диагностических наборов. При этом чувствительность метода составила 88 %, специфичность — 89 %, точность — 89 %. Доступность и простота постановки реакции, а также быстрота получения ответа позволяют применять данный метод в условиях любого лечебного учреждения индивидуально или в процессе скрининга в целях определения предварительного диагноза, а также в мониторинге процесса лечения больного и раннем выявлении рецидива заболевания.

Ключевые слова: онкологическое заболевание, ранняя диагностика, сыворотка жеребых кобыл, эмбриоспецифический антиген, сывороточный фактор, первичный скрининг

 

DOI: 10.17650/2313-805X-2017-4-3-99-103

Erythrocyte diagnosticum as used in revealingmalignant process

 

L.A. Savluchinskaya1, I.A. Bakulin2, А.А. Molodyk1

1N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia;

2Company “B-Pharm”; 13Barklaya St., Moscow 121309, Russia

 

A method is proposed for the development of an erythrocyte diagnosticum based on the evidence of patent № 2452501 (10.06.2012) via development of sensitine obtained from the serum of mares in foal, the above factor being used for diagnosis of malignant neoplasms. In order to reveal the practical significance of the diagnosticum proposed the findings of the testing of the blood serum of 215 patients with variously located tumors and from 67 individuals without malignant tumors are analyzed. Sensitivity of the method was 88 %, specificity — 89 %, accuracy — 89 %. The accessibility of the method proposed and simplicity of the reaction as well as the rapid response make it possible to use the method under discussion in any medical institution individually or in the course of screening to obtain primary diagnosis or to reveal risk groups.

Key words: cancer, early diagnostic, serum of mares in foal, embryospecific antigen, serum factor, initial screening

 

 

Введение

 

Предложен метод, в основе которого лежат данные о способе получения из сыворотки жеребых кобыл соединения, проявляющего стимулирующую активность в отношении злокачественных клеток, и использования его в качестве маркера для сенсибилизации эритроцитов в диагностическом тесте в целях выявления опухолевого процесса [1]. Авторы исходили из широко известного факта антигенного соответствия между эмбриональными, малигнизироваными и регенерирующими тканями: при неопластической трансформации обнаруживаются антигены, характерные для ранних этапов развития зародыша (эмбриональные или стадио- специфические антигены) [2]. При развитии зародыша и процесса регенерации ткани это лишь кратковременный этап, который сменяется дальнейшими стадиями роста и дифференцировки [3]. Появление же эмбриональных антигенов в опухоли представляет собой процесс блокировки нормальной клеточной дифференци- ровки, что стабилизирует процессы пролиферации [2]. Выявление эмбриональных антигенов в биологических жидкостях или тканях организма делает их значимыми маркерами опухолевого процесса [4, 5]. Необходимо отметить, что перекрестные реакции эмбриональных антигенов наблюдаются независимо от видовой принадлежности клеток, именно поэтому один из первых опухолеассоциированных антигенов — альфа-фетопротеин — изначально идентифицирован в сыворотке крови эмбриона мыши и в крысиных и мышиных гепато- мах, затем он был обнаружен при первичном раке печени человека. Выявлено большое количество опухолеассоциированных антигенов, на основании которых разработаны иммунодиагностические тесты, однако разница в содержании этих антигенов в опухолях и нормальных тканях носят не абсолютный, а количественный характер [5]. Кроме того, считается, что один маркер не может обеспечить высокую точность диагностики из-за гетерогенности опухоли и распространенности воспалительных и доброкачественных заболеваний [6]. В настоящее время используют мультимолекулярные тесты, результаты которых показали значительное увеличение специфичности и прогностической ценности по сравнению с использованием одного маркера [7]. Однако такой подход в диагностике не всегда и не везде доступен, поэтому поиск новых маркеров продолжается [8, 9]. Источником искомого нами специфического фактора, указывающего на наличие опухолевого процесса, служила сыворотка жеребых кобыл на ранних стадиях беременности.

 

Материалы и методы

 

В нашей работе для получения сенситина использовали сыворотку жеребых кобыл на 50-70-е дни беременности. Фракционирование данной сыворотки проводили методом жидкостной хроматографии. После пробных хроматографий с сефадексами G-50 и G-100 для дальнейшей работы выбран сефадекс G-50 с фосфатно-солевым буфером. Низкомолекулярные фракции в диапазоне 3000—15 000 KD лиофилизиро- ваны для проверки пролиферативной активности в МТТ-тесте с культурами опухолевых клеток (кишечника, яичников, молочной железы). Для приготовления эритроцитарного диагностикума фракционирование проводили несколько раз в целях получения достаточного количества вещества.

Методика приготовления диагностикума. Формали- низированные эритроциты барана были отмыты физраствором и буфером, обработаны таннином, затем 4 % суспензия эритроцитов сенсибилизирована полученными белковыми фракциями. Приготовлено несколько партий сенсибилизированных эритроцитов для отбора наиболее информативных в реакции с сыворотками больных и пациентов без онкологических заболеваний. Предварительный отбор и дальнейшее исследование по выявлению опухолевого процесса выполнялись на CELLSTAR 96 well cell Culture PlateV bottom.

Постановка реакции. Каждый ряд плашки (8 лунок) занимает одна тестируемая сыворотка, фактор разведения, начиная со 2-й лунки — 1:2. Последовательные тестовые образцы имеют уменьшающуюся в 2 раза концентрацию сыворотки крови (от 1/20 до 1/2560). Затем в каждую лунку добавляют суспензию сенсибилизированных эритроцитов и оставляют на 3—4 ч для проявления реакции агглютинации. Сенситин, сенсибилизированный на эритроцитах, реагирует с фактором, являющимся посредником или самим белком, вызывающим реакцию пролиферации. Если его количество велико, то реакция агглютинации происходит при высоких разведениях сыворотки, если нет — эритроциты оседают в первых лунках, так как их ничто не связывает. Чтобы определить «шкалу», т. е. разведения сыворотки, вызывающие реакцию агглютинации, мы провели предварительное тестирование сыворотки 10 здоровых лиц и 10 больных с опухолями (рак толстой кишки, яичников, легкого). Наличие опухолевого процесса определяется при реакции агглютинации, соответствующей разведению сыворотки не менее 1:320 (разведение 1:160 можно считать пограничным).

Специфичность, чувствительность и точность метода определяли по общепринятым формулам. Чувствительность рассчитывается как

а / (а + b) х 100,

где а — положительный ответ в группе больных, b — отрицательный ответ в этой группе. Специфичность с / (с + d) х 100,

где с — отрицательный ответ в группе здоровых лиц, d — положительный ответ в этой группе. Точность (а + с) / (a + b + с + d) х 100.

 

 

 

Результаты

 

В целях подтверждения возможности использования диагностикума для обнаружения опухолевого процесса нами протестированы сыворотки крови 215 первичных больных с подозрением на наличие злокачественного процесса. В дальнейшем при клиническом обследовании этих пациентов диагноз был подтвержден. В качестве контроля протестированы образцы сыворотки крови пациентов без выявленных злокачественных новообразований. Полученные данные представлены в табл. 1.

Таким образом, с учетом положительных и отрицательных ответов точность метода составила 89 %.

Данные клинически установленных гистологических типов опухолей у тестируемых больных и наличие отрицательного ответа в сыворотке крови у этой группы приведены в табл. 2.

Мы проанализировали полученные результаты в зависимости от гистологического типа опухолей. Интересно, что в группе больных раком яичников при гистологическом диагнозе эндометриозной аденокарциномы положительный ответ отмечен у всех 18 пациентов, в то время как при серозном раке у 2 из 8 больных реакция оказалась отрицательной (75 % выявлений). Из 9 больных с диагнозом пигментной эпителиоклеточной меланомы отрицательный ответ получен у 1 пациента (89 % выявлений), из 6 больных беспигментной меланомой — у 2 (67 % выявлений).

 

Следует отметить, что при раке легкого, молочной железы и толстой кишки четкой зависимости между выявлением и гистологическим типом опухоли не зафиксировано. Также мы не обнаружили зависимости в отношении опухолей различной степени дифферен- цировки. Так, при раке толстой кишки высокодифференцированная аденокарцинома диагностирована у 27 больных (отрицательных — 3; 89 % выявлений), низкодифференцированная аденокарцинома — у 7 (отрицательных — 0). Ввиду небольших выборок эти факты требуют дальнейшего исследования, особенно в отношении рака яичников и меланомы.

 

Заключение

 

В последние годы внимание исследователей привлечено к изучению ауто-/паракринных факторов роста, их рецепторов и некоторых нижележащих сигнальных белков, а также к выявлению их роли в качестве ауто-/паракринного регулятора в развитии и течении злокачественных опухолей [10, 11]. Считается, что в основе способности опухоли к неограниченному автономному росту лежат эффекты факторов роста, продуцируемых различными компонентами тканей, взаимодействующих со специфическими трансмембранными рецепторами и связывающие эти факторы белками крови (так называемая сигнальная система), стимулируя в результате последующей сложной цепи событий клеточное деление. К настоящему времени выявлено несколько десятков различных факторов роста. Система реализации эффектов факторов роста включает рецепторы и связывающие белки, которые образуют сложно регулируемую сеть взаимодействия как между собой, так и с другими биологи - ческими регуляторами роста и выживания клеток. Противоречивость и неоднозначность результатов исследования роли компонентов сигнальных систем в патогенезе опухолей человека отражают сложность взаимоотношений между механизмами регуляции нормального роста клеток и канцерогенеза.

Наиболее изученными и клинически реализованными являются сигнальная система с участием рецептора эпидермального фактора роста и родственных ему рецепторов, а также сигнальная система инсулиноподобных факторов роста 1 и 2 их трансмембранные рецепторы и связывающие факторы роста белки. В целом анализ экспрессии рецепторов факторов роста, их лигандов, а также активности нижележащих сигнальных путей становится в настоящее время неотъемлемой составляющей комплексного обследования онкологического больного, необходимого для разработки и тактики лечения.

В нашей работе представлен эритроцитарный диаг- ностикум, для приготовления которого использован сывороточный фактор (сенситин), выделенный из сыворотки жеребых кобыл на ранних стадиях беременности. Используемый нами сенситин, очевидно, можно отнести к ауто-/паракринным факторам роста. Положительный ответ, полученный у пациентов с наличием злокачественных опухолей, указывает на присутствие у этих больных компонентов сигнальной системы, стимулирующей развитие опухолевого процесса, но идентификация данного фактора роста и выявление компонентов сигнальной системы требуют дальнейших углубленных исследований.

Тестирование сыворотки крови 215 онкологических больных и 67 лиц с отсутствием злокачественных заболеваний, показавшее высокую точность (89 %) эритроцитарного диагностикума, а также доступность и простота метода позволяют рекомендовать его для использования в лечебных учреждениях в целях раннего обнаружения опухолевого процесса.

 

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCE

 

1. Патент РФ № 2452501 (дата публикации 10.06.2012). Патентообладатели: Балюра А. В., Молодык А. А., Савлучин- ская Л.А., Тарасов С.Г. [Patent of Russian Federation No. 2452501 (publication date 10.06.2012). Patentees: Balyura A.V., Molodyk A.A., Savluchinskaya L.A., Tarasov S.G. (In Russ.)].

2. Косяков П.Н., Косякова Н.П. Антигены опухолей человека. М.: Медицина, 1985. 270 c. [Kosyakov P.N., Kosyakova N.P. Antigens of human tumors. Moscow: Meditsina, 1985. 270 p. (In Russ.)].

3. Fiher B., Gunduz N., Coyle J. et al. Presence of growth stimulating factor in serum-following primary tumor removal in mice. Cancer Res 1989;49(8):1996—2001.

4. Кушлинский Н.Е., Герштейн Е.С., Любимов Н.В. Биологические маркеры опухолей: методические аспекты и клиническое применение. Вестник Московского онкологического общества 2007; 1. [Kushlinskiy N.E., Gershteyn E.S., Lyubimov N.V. Biological markers of tumors: methodical aspects and clinical application. Vestnik Moskovskogo onkolo- gicheskogo obshchestva = Bulletin of the Moscow Cancer Society 2007;1.

(In Russ.)].

5. Сергеева Н.С, Маршутина Н.В. Серо- логическические опухолевые маркеры. В кн.: Онкология. Национальное руководство. Под ред. В.И. Чиссова,

М.И. Давыдова. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. С. 8-26. [Sergeeva N.S., Marshu- tina N.V. Serological tumor markers.

In book: Oncology. National leadership. Eds.: V.I. Chisov, M.I. Davydov. Moscow: GEOTAR-Media, 2008. Pp. 8-26.

(In Russ.)].

6. Marusyk A., Almendro V., Polyak K. Intra-tumou heterogenity: a looking glass for cancer? Nat Rev Cancer 2012;12(5):323—34.

7. Prior C.C., Guillen Grima E, Robles J.E. et al. Use of a combination of biomarkers in serum and urine to improve detection of prostatic cancer. World Unol 2010;28(6):681—6.

8. Mabert K., Cojoc M., Peitzsch C. et al. Cancer biomarker discovery: current status and future perspectives. Int J Radiat Biol 2014;90(8):659—77.

9. Teng P.N., Bateman N.W., Hood B.L., Comads T.P. Advances in proximal fluid proteomics for disease biomarker discovery. J Proteome Res 2010;9(12):6091 —100.

10. Доненко Ф.В., Кабиева А.О., Эф- ферт Т.Ф. Сывороточные опухолеспецифические факторы — необходимое условие роста опухоли в организме. Клиническая лабораторная диагностика 2013;(10):13—5. [Donenko F.V., Kabieva A.O., Effert T.F. Serum tumor- specific factors are a necessary condition for tumor growth in the body. Klinicheskaya laboratornaya diagnos- tika = Clinical Laboratory Diagnostics 2013;(10):13—5. (In Russ.)].

11. Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е. Факторы роста, их рецепторы и нижележащие сигнальные белки: от эксперимента к клинике. Успехи молекулярной онкологии 2014;(1): 27-35. [Gershteyn E.S., Kushlinskiy N.E. Growth factors, their receptors and downstream signaling proteins in human tumors: from experiment to clinical practice. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2014;(1):27—35. (In Russ.)].

 

 

 

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ / ADVANCES IN MOLECULAR ONCOLOGY 3 ’ 2017/ ТОМ 4 / VOL. 4